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Nature Communications volume 13、記事番号: 7962 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

ペニシリン結合タンパク質 (PBP) の d,d-トランスペプチダーゼ活性は、ペプチドグリカンの重合をブロックする β-ラクタム系抗生物質の主な標的であることがよく知られています。 β-ラクタム誘導性の細菌死滅には複雑な下流反応が関与しており、その原因と結果を解決するのは困難です。今回我々は、β-ラクタム非感受性1,d-トランスペプチダーゼによるPBPの機能的置換を利用して、活発に分裂する細菌におけるβ-ラクタムによるPBP不活化の影響を軽減するために不可欠な遺伝子を同定する。このアプローチによって同定された 179 個の条件付き必須遺伝子の機能は、ペプチドグリカン重合の 1,d-トランスペプチダーゼパートナーをはるかに超えて、ストレス応答や外膜ポリマーの構築に関与するタンパク質にまで及びます。 β-ラクタムの予期せぬ影響には、外膜とペプチドグリカンを結び付けるリポタンパク質を介した共有結合の喪失、ペプチドグリカンの効果的な架橋にもかかわらず細胞エンベロープの不安定化、外膜の透過性の増加などが含まれます。後者の効果は、β-ラクタムの作用機序が外膜の自己促進的な浸透に関与していることを示しています。

大腸菌などのグラム陰性菌は、細胞質の膨圧を維持する多層エンベロープ (細胞壁ペプチドグリカン) を持ち、栄養素、老廃物、有毒化合物 (内膜と外膜) に対する選択的な化学障壁として機能します (図) . 1a)1．タンパク質、ペプチド、グリカン、脂質部分を含むいくつかのポリマーが、エンベロープの機械的特性と輸送機能を保証します。ブラウンリポタンパク質を介して外膜に共有結合しているペプチドグリカン（PG）は、二糖-ペンタペプチド単位から重合した巨大な網状高分子（約109Da）です（図1b）。グリコシルトランスフェラーゼは、二糖間のβ-1,4グリコシド結合の形成を触媒してグリカン鎖を形成し、その後トランスペプチダーゼによって相互に架橋されます（図1c）。後者の酵素である d,d-トランスペプチダーゼは、β-ラクタム系抗生物質の必須の標的であるため、ペニシリン結合タンパク質 (PBP) とも呼ばれます。ペプチドグリカンの重合では、PBP はペンタペプチドステムの d-Ala4-d-Ala5 末端と相互作用し (したがって d,d と呼ばれます)、d-Ala4 とその活性部位の Ser 残基との間に共有結合を形成し、同時に d が放出されます。 -アラ5。次のステップでは、得られたアシル酵素が2番目の基質（ほとんどの場合はテトラペプチドステム）と反応して、4→3架橋されたテトラ-テトラ二量体を形成し、同時にPBPが放出されます（図1c;補足図）。 S1a)2. d,d-トランスペプチダーゼは、足場タンパク質やエンドペプチダーゼと協力して、拡張するPG網状高分子へのグリカン鎖の挿入を仲介し、それによって細菌の形状を決定し、細胞全体の細胞質の浸透圧に対する機械的障壁を確保します。サイクル3、4、5、6、7。

a エンベロープは内膜 (IM、灰色) と外膜 (OM、黒色) で構成されています。ペプチドグリカン (PG、青) は細菌細胞の浸透圧保護を保証します。 IM は主にリン脂質 (PL) から構成される脂質二重層です。 OM は非対称脂質二重層です。内側のリーフレットは PL で構成され、外側のリーフレットはリポ多糖類 (LPS) と腸内細菌共通抗原 (ECAPGL) で置換されたホスファチジルグリセリドで構成されています。 b PG サブユニットの構造 (GlcNAc、N-アセチル-グルコサミン; MurNAc、N-アセチル-ムラミン酸)。 c PG は、短いペプチドステム (色付きの円) によって架橋されたグリカン鎖 (青紫色の多角形) で構成される網状の高分子です。 PBP は、アシル供与体ステムの 4 番目の位置を受容体の 3 番目の位置に接続する 4 → 3 架橋の形成を触媒します。 LDT ファミリーの 2 つのメンバー (YcbB および YnhG) は、3 → 3 架橋の形成を触媒します。 3 つの LDT (ErfK、YbiS、および YcfS) がブラウンリポタンパク質 (Lpp) を PG に固定します。 PGドナーステムの3番目の位置にあるDAPをLppのArg-Lys末端に連結すると、OMとPGの間に共有結合が形成されます。 PG-Lpp リンクは YafK LDT によって加水分解されます 46,47。 d セフトリアキソンなしで増殖させたBW25113株(ycbB、relA')からのムロペプチドのrpHPLCプロファイル。構造は、MurNAc-GlcNAc β-1,4 結合を切断するムラミダーゼによる PG の消化によって得られた断片から推測されます。 e 質量分析分析から推定されたムロペプチドの構造。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

90% of the resulting muropeptides recycled by the cell37,38. This involves the retrograde transport of PG fragments into the cytoplasm by specialized permeases, AmpG and the Opp complex, followed by the recycling of the sugar and peptide moieties as glucosamine and tripeptide l-Ala-γ-d-Glu-DAP, respectively (Fig. 4a). Tn-seq analysis showed that genes encoding the AmpG permease and each component of the Opp complex were fully dispensable for growth both in −CRO and +CRO conditions. We further demonstrated that PG recycling was fully dispensable by constructing a ΔampG ΔoppF ΔmppA triple mutant that was found to be viable and resistant to ceftriaxone in spite of the loss of both transporters (Supplementary Fig. S3a). Nevertheless, the cytoplasmic l,d-carboxypeptidase LdcA was essential in the +CRO but not in the −CRO condition (Supplementary Data File 1b; Supplementary Data File 2). This enzyme was previously shown to trim d-Ala4 from recycled tetrapeptide stems to provide the l-Ala-γ-d-Glu-DAP tripeptide that is directly added to UDP-MurNAc by the Mpl ligase39,40. Disruption of the gene encoding LdcA was reported to result in bacteriolysis during stationary growth, attributed to dramatically decreased cross-linking as recycled tetrapeptide stems cannot serve as acyl donors by d,d-transpeptidases (Supplementary Fig. S1)40. The same explanation cannot account for the essential role of LdcA in ceftriaxone resistance since YcbB uses tetrapeptide stems as acyl donors8. Nonetheless, the essential role of LdcA in the +CRO condition stemmed from elimination of imported tetrapeptides since deletion of the mpl gene restored growth of the ΔldcA mutant in the presence of ceftriaxone (Supplementary Fig. S3a). Overexpressing murA, encoding the enzyme catalyzing the first committed step of PG synthesis (Fig. 4a), also restored resistance of the ΔldcA mutant (Supplementary Fig. S3b). Thus, boosting the metabolic flux trough the PG assembly pathway compensates for the toxicity of the imported tetrapeptides. Together, these results indicate that Mpl ligates the tetrapeptide onto UDP-MurNAc and that in the absence of LdcA the resulting tetrapeptide-containing precursors are ineffectively used in subsequent PG synthesis steps and impair the global efficacy of the pathway./p> 40-fold reduction of the MIC of the detergent (Fig. 6b). Growth in the presence of ceftriaxone also increased susceptibility to vancomycin, moenomycin, bacitracin, and erythromycin, which are known to poorly penetrate the outer membrane of Gram-negative bacteria (Fig. 6c). Together, these data indicate that bypass of PBPs by YcbB was associated with the permeabilization of the outer membrane in the presence of ceftriaxone. This implies that the mode of action of β-lactams may involve a positive loop in which binding of the drugs to their targets promotes drug access to the periplasm. Damage to the outer membrane mediated by reactive oxygen species (ROS) may be involved in this process since increased lipid peroxidation was detected by a colorimetric assay (Supplementary Fig. S7h)./p> transposome® (Lucigen). For each electroporation, transformed cells were incubated at 37 °C for 1 h in 2 ml of BHI broth supplemented with 10 µg/ml tetracycline and 20 µg/ml chloramphenicol. Cells were plated on 20 BHI agar plates (100 µl per plate) supplemented with 50 µg/ml kanamycin, 40 µM IPTG, and 1% l-arabinose in the absence (condition −CRO) or presence (condition +CRO) of 8 µg/ml ceftriaxone. Plates were incubated at 37 °C for 16 h (condition −CRO) or 24 h (condition +CRO). Cells were recovered from sets of 20 plates (corresponding to the same electroporation) in two steps by scrapping with 4 ml of BHI broth containing 20% glycerol followed by an additional wash of the plates with 4 ml of the same medium. The bacterial suspensions obtained for each electroporation were kept at −80 °C. For the −CRO condition, a total of 810,000 CFUs was obtained in 7 electroporations. For the +CRO condition, a total of 260,000 CFUs was obtained in 10 electroporations./p> 0.05 or a fold-change < 4 were eliminated. The resulting set of 179 genes is listed in Supplementary Data File 1b. For pathways or gene clusters containing selectively essential genes in the +CRO condition, we also considered non-essential genes displaying a significantly reduced number of insertions in the +CRO condition (p < 0.05). These genes were deemed to incur a fitness cost./p>